O que é uma reação em cadeia da polimerase (pcr)? fatos sobre teste, etapas e usado para

O que é PCR (reação em cadeia da polimerase)?

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica que é usada para amplificar vestígios de DNA (e, em alguns casos, RNA) localizados em ou sobre quase qualquer líquido ou superfície onde os filamentos de DNA possam ser depositados. A chave para entender a PCR é saber que todo ser humano, animal, planta, parasita, bactéria ou vírus contém material genético como sequências de DNA (ou RNA) (seqüências de nucleotídeos ou pedaços de DNA ou RNA) que são exclusivos de suas espécies, e ao membro individual dessa espécie. Conseqüentemente, se uma amostra contém segmentos de DNA ou RNA, a PCR é um método usado para amplificar (fazer muitas cópias mais idênticas) dessas sequências únicas, para que elas possam ser usadas para determinar com uma probabilidade muito alta a identidade da fonte. pessoa específica, animal ou organismo patogênico) do DNA ou RNA traço encontrado em ou sobre quase qualquer amostra de material.

A amplificação por PCR é apenas parte do teste de identificação, no entanto. Uma vez que a amplificação é feita (ver abaixo), os segmentos amplificados precisam ser comparados a outros segmentos de nucleotídeos de uma fonte conhecida (por exemplo, uma pessoa específica, animal ou organismo patogênico). Esta compara�o de segmentos �icos �frequentemente feita colocando sequ�cias nucleot�icas geradas por PCR perto de sequ�cias nucleot�icas conhecidas de humanos, patog�ios ou outras fontes num gel de separa�o. Corrente elétrica é passada através do gel e as várias seqüências de nucleotídeos formam bandas que se assemelham a uma "escada" de acordo com sua carga elétrica e tamanho molecular. Isso é denominado eletroforese em gel. Bandas ou "degraus", como etapas que migram para os mesmos níveis no gel, mostram a identidade das seqüências de nucleotídeos. Este método é uma das formas mais populares pelas quais os testes de PCR são completados (Veja a Fig. 1).

Figura 1, Bandas ou degraus semelhantes a "escada" de PCR produziram DNA de Mycobacterium (cortesia do CDC)

Figura. Padrão repetitivo (Rep) - PCR (A) e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) (B) padrões de isolados de Mycobacterium cosmeticum de 2 pacientes em Ohio e 1 paciente na Venezuela. A rep-PCR foi realizada utilizando o iniciador BOXA1R (3) e a PFGE foi realizada com a enzima de restrição AseI. Lanes 1, 2, Ohio isola OH1 e OH2; pistas 3, 4, estirpes de controlo ATCC BAA-878T e ATCC BAA-879; faixa 5, venezuelana isolar VZ1. Os padrões de tamanho de DNA são de 100 pb (S1) e 48, 5 kb (S2).

Como é feita a PCR (reação em cadeia da polimerase)?

Em 1983, Kary Mullis descobriu os passos básicos para amplificar sequências de DNA. Ele e Michael Smith receberam o Prêmio Nobel pelo desenvolvimento desse procedimento em 1993. Há alguns passos básicos seguidos em seqüência; A PCR pode ser feita em um único tubo com produtos químicos apropriados e um aquecedor especialmente projetado. Os reagentes ou produtos químicos necessários são os seguintes:

• Uma amostra que contém uma sequência nucleotídica (de sangue, cabelo, pus, raspagem da pele, etc.)
• Primers de DNA: DNA curto de fita simples que se liga a seqüências de nucleotídeos que promovem a síntese de uma cadeia complementar de nucleotídeos
• DNA polimerase: uma enzima que, quando o DNA tem um primer ligado, desce pelo segmento de DNA ligando blocos de DNA para formar pares de bases complementares e assim sintetiza uma cadeia nucleotídica complementar de DNA (a introdução de uma DNA polimerase resistente ao calor, Taq A polimerase, derivada de bactérias resistentes ao calor, melhorou acentuadamente a capacidade de realizar PCR
• Um grande excesso de blocos de construção de DNA, denominados nucleotídeos (adenina, timidina, citosina e guanina, abreviados como: A, T, C e G, respectivamente) estão presentes na solução. Quando esses blocos estão ligados, eles formam uma seqüência de nucleotídeos ou uma única fita de DNA. Quando estes blocos de construção ligam o seu bloco de construção complementar por ligações de hidrogénio fracas (por exemplo, A ligará apenas com T e G apenas com C) uma sequência de nucleótidos de ADN complementar é formada e ligada ao ADN de cadeia simples original. Quando a ligação é completada, um DNA complementar de fita dupla é formado em uma seqüência específica.

A PCR, então, começa com um segmento de DNA de uma amostra que é colocada em um tubo com os reagentes listados acima. A solução é aquecida a pelo menos 94 ° C (201, 2 ° F); esse calor quebra as ligações de hidrogênio que permitem que as cadeias de DNA complementares se formem, de modo que apenas cadeias únicas existem na mistura (isso é denominado desnaturação do DNA de cadeia dupla).

A mistura é deixada a arrefecer até cerca de 54 ° C (129, 2 ° F). A esta temperatura, os iniciadores de ADN e a polimerase de ADN ligam-se a ADN de cadeia simples individual (isto é denominado recozimento do ADN). Como os blocos de construção estão em excesso (alta concentração) na mistura, a polimerase usa-os para fazer novas cadeias complementares de DNA (denominado extensão do DNA) e esse processo é mais rápido a 72 ° C (161, 6 ° F). Esse processo cria uma nova molécula de DNA de fita dupla de cada uma das fitas da molécula original.

Este ciclo é repetido cerca de 40 vezes numa máquina denominada termociclador que repete automaticamente os ciclos de aquecimento-arrefecimento, com a quantidade de cada sequência de ADN a duplicar de cada vez que o ciclo de arrefecimento de aquecimento é completado. O que inicialmente foi um único segmento curto de DNA pode ser amplificado para cerca de 100 bilhões de cópias após 40 ciclos de duplicação.

Por que um médico solicitaria um teste de PCR (reação em cadeia da polimerase)?

O teste de PCR forma a base de vários testes que podem responder a várias questões médicas que ajudam os médicos a diagnosticar e tratar pacientes. Por exemplo, testes de PCR podem detectar e identificar organismos patogênicos em pacientes, especialmente aqueles que são difíceis de cultivar (por exemplo, HIV e outros vírus e certos fungos).

Outros médicos pedem testes de PCR para ajudar a diagnosticar doenças genéticas, enquanto outros médicos usam PCR para detectar relacionamentos biológicos, como identificar pais de crianças. Testes de PCR também são usados ​​para identificar e caracterizar mutações genéticas e rearranjos encontrados em certos tipos de câncer.

No entanto, os testes de PCR foram modificados e estendidos em muitos aspectos de investigações científicas, incluindo biologia evolutiva, impressões digitais genéticas, investigações forenses e muitas outras.

O que é RT-PCR?

RT-PCR é um teste de PCR projetado para detectar e medir o RNA. Embora os testes iniciais de PCR amplifiquem o DNA, muitos vírus e outros componentes biológicos (por exemplo, mitocôndrias) utilizam o RNA como seu material genético. A RT-PCR difere da PCR convencional, primeiro tomando RNA e convertendo a cadeia de RNA em uma fita de DNA. Isto é feito essencialmente pelo mesmo método para PCR descrito acima com a excepção de utilizar uma enzima denominada transcriptase reversa em vez da ADN-polimerase. A transcriptase reversa permite que uma única fita de RNA seja traduzida em uma fita complementar de DNA. Uma vez que essa reação ocorre, o método de PCR de rotina pode ser usado para amplificar o DNA. A RT-PCR foi usada para detectar e estudar muitos vírus de RNA.

A RT-PCR não deve ser confundida com outra variação da PCR, denominada Real-Time PCR. A PCR em tempo real é uma variação da PCR que permite a análise do DNA amplificado durante os 40 ciclos usuais do procedimento. Embora o procedimento seja semelhante ao PCR convencional com ciclagem, o PCR em tempo real usa corantes fluorescentes ligados a alguns dos blocos de construção ou pequenos filamentos de nucleotídeos. Dependendo do método utilizado, a fluorescência ocorre quando os filamentos de DNA amplificados são formados. A quantidade de fluorescência pode ser medida ao longo dos 40 ciclos e permite aos investigadores medir produtos específicos e suas quantidades durante os ciclos de amplificação. Isso geralmente permite que os pesquisadores ou técnicos de laboratório pule a eletroforese em gel ou outros procedimentos secundários necessários para a análise dos produtos de PCR, produzindo resultados mais rápidos.

PCR em tempo real e RT-PCR são variações ou modificações do teste de PCR original. No entanto, existem muitas outras variações (pelo menos 25) que existem e são usadas para resolver problemas específicos. Todos eles têm nomes diferentes, como Assembly PCR, PCR de arranque a quente, PCR multiplex, PCR de fase sólida e muitos outros.

A PCR provavelmente continuará a ser modificada para ajudar a responder a quaisquer outras questões em medicina, biologia. e outros campos de estudo.